第 2 节 动物细胞工程 2.2.1 动物细胞培养 烧伤病人图片 异体皮肤移植图片 如何解决异体器官移植的免疫排斥反应？ 从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的办法是取 烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的 病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮 肤来源又不足，而且产生免疫排斥反应。那么， 怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自 体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？ 一、动物细胞工程常用的技术 动物细胞工程常用的技术动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移 植、生产单克隆抗体，其中动物细胞培养是最基础的技术。 克隆皮肤 克隆猴：中中和华华 单克隆抗体 二、动物细胞培养的概念和原理 1. 概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞 ，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 2. 原理：动物细胞培养的原理是：细胞增殖 动物细胞培养需要哪些条件？ 动物细胞培养的基本操作过程是怎样的？ 怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险 ？ 三、动物细胞培养的条件 三、动物细胞培养的条件 1. 营养条件 : (1) 合成培养基 : 将细胞所需的营养物质按 _____________ 严格配制而成。 种类和所需量 营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、 (2) 天然成分 :_____ 等。 微量元素等。 (3) 一般使用 _____ 培养基注意：这里的糖类不能是淀粉 , 即培养液。 血清 液体 为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？ 血清中含有多种维持细胞代谢和生长的物质，如蛋白质、氨基酸、未 知的促细胞生长因子等。 三、动物细胞培养的条件 2. 无菌、无毒的环境 : (1) 培养液和培养用具 _____ 处理。 灭菌 (2)_____ 环境下操作。 (3) 培养液定期更换的原 无菌 因 :_______________________________________________ 3. 温度、 pH 和渗透压 : 清除代谢物 , 防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害 (1) 适宜的温度 : 哺乳动物多以 __________ ℃ 为宜。 (2) 适宜的 pH: 多数细胞生存的适宜 pH 为 _________ 。 36.5±0.5 (3) 适宜的渗透压。 4. 气体环境 :95% 空气和 5%CO2 的 CO2 培养箱中。 7.2 ～ 7.4 (1)O2 作用 :_________________ 。 (2)CO2 的主要作用 :_______________ 。 细胞代谢所必需的 维持培养液的 pH 四、动物细胞培养的过程 1. 动物细胞培养的步骤： 思考 1. 为什么切取组织块进行 细胞培养时，常选择动物胚胎或 幼龄动物的组织、器官？ 分化程度低，增殖能力强 思考 2. 培养前为什么分散成单 个细胞？ ① 成块组织中细胞与细胞靠在 一 起，彼此限制了生长与增殖； ② 利于与培养液充分接触，保证 取动物组织 （动物胚胎或幼龄动物） 用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶处 理 单个细胞 加培养液 细胞悬液 在培养皿或 培养瓶中 原代培养 （ 10 代以内） 悬浮培养的细胞直接用离心法收 集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞后，在离心法收 集 （ 10 代以后） 传代培养 四、动物细胞培养的过程 1. 动物细胞培养的步骤： 思考 3. 将组织分散成单个细胞 时为什么要用胰蛋白酶（或胶原 蛋白酶）处理？胃蛋白酶可以吗 胰蛋白酶可以将动物组织细胞 ？ 间的蛋白质成分酶解，使细胞 分散开，获得单个细胞。胃蛋 取动物组织 （动物胚胎或幼龄动物） 用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶处 理 单个细胞 加培养液 细胞悬液 在培养皿或 培养瓶中 白酶不可以， pH 不适宜。 原代培养 （ 10 代以内） 思考 4. 在用胰蛋白酶处理组织 悬浮培养的细胞直接用离心法收 集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞后，在离心法收 集 （ 10 代以后） 传代培养 时应注意什么？ 细胞膜含有蛋白质，长时间处 理会损伤细胞，要控制好时间 四、动物细胞培养的过程 1. 动物细胞培养的步骤： 思考 5. 体外动物细胞培养的方 法有哪些？ ① 悬浮在培养液中生长增殖（悬 浮培养）； ② 贴附与某些基质表面才能生长 增殖，大多数细胞属于这种类型， 这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁 上，称为细胞贴壁。 取动物组织 （动物胚胎或幼龄动物） 用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶处 理 单个细胞 加培养液 细胞悬液 在培养皿或 培养瓶中 原代培养 （ 10 代以内） 悬浮培养的细胞直接用离心法收 集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞后，在离心法收 集 （ 10 代以后） 传代培养 四、动物细胞培养的过程 1. 动物细胞培养的步骤： 取动物组织 （动物胚胎或幼龄动物） 思考 6. 原代培养到什么状态时 用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶处 理 单个细胞 ，需要传代培养？ ① 悬浮培养的细胞因细胞密度过大 、有害代谢物积累和培养液中营养物 质缺乏等因素分裂受阻； ② 贴附细胞处上述因素影响外，还 加培养液 细胞悬液 在培养皿或 培养瓶中 会发生接触抑制现象而停止分裂增殖 原代培养 （ 10 代以内） 悬浮培养的细胞直接用离心法收 。 集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞后，在离心法收 集 （ 10 代以后） 传代培养 四、动物细胞培养的过程 1. 动物细胞培养的步骤： 取动物组织 （动物胚胎或幼龄动物） 思考 7. 动物细胞培养能否体现动 用机械的方法，或用胰 蛋白酶、胶原蛋白酶处 理 单个细胞 物体细胞的全能性 ? 说明你的理 由。 不能。动物细胞培养只是细胞的 增殖 , 没有体现细胞的全能性。 加培养液 细胞悬液 在培养皿或 培养瓶中 原代培养 （ 10 代以内） 悬浮培养的细胞直接用离心法收 集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞后，在离心法收 集 （ 10 代以后） 传代培养 2. 动物细胞培养的过程示意图 机械法、 胰蛋白酶或胶 原蛋白酶处理 ，将组织分散 成单个细胞 制成细胞悬液 传代培养 传 10 代以后的细 动物胚 胎或幼龄 动物的组 织、器官 取动物组织 转入培养液中 进行原代培养 第 1 代细胞到 10 代以内的细 胞 机械法 胰蛋白酶 胶原蛋白酶 放入 CO2 培养箱中培 养 接触抑制 3. 相 关 概 念 理 解 ： （ 1 ）细胞贴壁— 悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生 长的现象； 要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴 附） （ 2 ）接触抑制—当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时 ，细胞就会停止分裂增殖的现象 细胞的接触抑制 3. 相 关 概 念 理 解 ： （ 3 ）原代培养和传代培养、细胞株和细胞系 随细胞增多，大部分细胞就会停止分裂增 殖 遗传物质有的改变 细胞株 细胞悬浮液 10 代细 胞 原代培养 多数细胞固定在 表面生长和分裂 遗传物质改变 细胞系 50 代细 无限传代 胞 洗涤、稀释、分瓶培养 传代培养 细胞株：原代细胞一般传至 10 代左右细胞生长停滞，大部分细胞 衰老死亡，少数细胞存活到 40~50 代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至 50 代后又出现细胞生长停滞状态，只有 部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制 传代，这种传代细胞为细胞系。 区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触 抑制，容易传代培养。 4. 植物组织培养和动物细胞培养的比较 比较项目 原理 取材 培养基性质 培养基成分 是否体现细胞全能 性 培养目的 植物组织培养 植物细胞全能性 动物细胞培养 细胞增殖 离体的细胞 、组织、器 官 固体培养基 动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官 矿质元素、蔗糖 、维生素、植物 激素等 葡萄糖、氨基酸、 无机盐、维生素等 及动物血清 是 植物体个体或愈伤 组织 液体培养基 否 获得大量细胞或 细胞代谢产物 5. 动物细胞培养的过程跟踪练习 机械法或胰蛋白酶、胶原 1. 过程①处理方法 蛋白酶等处理的方法 有 :_____________________ 。 转入培养液中进行原代培养 2. 过程②为 _____________________________ 培养液 3. 培养的动物细胞有两类 贴附于某些基质表面 : ① 悬浮在 _______ 中生长增殖 ; 传代 ②___________________ 生长增殖。 有害代谢物 4. 过程③为 _____ 培养 , 进行过程③的原因 营养物质 主要有 : 细胞密度过大、 ___________ 积累 、 _________ 缺乏和接触抑制等。 离心法 5. 进行过程③时 , 悬浮培养的细胞直接用 胰蛋白酶 离心法 _______ 收集 ; 贴壁细胞需要使用 五、干细胞培养及其应用 1. 干细胞存在于 ____________________________________________ 早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中 2. 干细胞类型 _____________________________________ 胚胎干细胞（ ES 细胞）和成体干细胞 （ 1 ）胚胎干细胞（ ES 细 胞） 早期胚胎 ① 分布： ②具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进 特点： 一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干 ③ES 成功案例： 细胞等细胞