第 1 章　发酵工程 第 1 节　传统发酵技术的应用 一、发酵与传统发酵技术 1．发酵: (1)概念：发酵是指人们利用 微生物 ，在适宜的条件下，将原料通过 微生物 的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 (2)原理：不同的微生物具有产生不同 代谢物 的能力，因此利用它们就可以生产出 人们所需要的多种产物。 2．传统发酵技术 (1)概念：直接利用 原材料 中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的 面团 、 卤汁 等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。 (2)特点：传统发酵以混合菌种的 固体 发酵及 半固体 发酵为主。 (3)发酵产品：利用传统发酵技术制作的食品有 腐乳 、酱、酱油、醋、 泡菜 和豆豉等。 3．腐乳的制作 (1)参与的微生物：多种微生物参与了豆腐的发酵，其中起主要作用的是 毛霉 。 (2)腐乳的特点：豆腐中的蛋白质被分解成小分子的 肽 和 氨基酸 。 二、尝试制作传统发酵食品 1.传统发酵食品所利用的微生物 (1)乳酸菌：代谢特点: 异养厌氧型 发酵原理: (2)酵母菌—真核 生物，代谢特点: 兼性厌氧型 型。 发酵原理: 醋酸菌—— 原核 生物，代谢特点: 异养好氧型 型。 发酵原理:①O2、糖源都充足时: ② 缺少糖源时,则将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变为乙酸: 2. 制作传统发酵食品——制作泡菜 (1)要控制好盐水的浓度：若浓度过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；若浓度过低， 杂 菌易繁殖 ，导致泡菜变质。 (2)严格控制厌氧条件：①制作泡菜所用容器须 密封性良好；②泡菜坛用 水 密封。 (3)装坛时压实，装八成满 ；盐水须没过全部菜料。 (4)泡菜制作前盐水煮沸的作用：一是除去 水中氧气 ，二是杀灭盐水中的 其他微生物。 (5)在制作泡菜前，可以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”，其目的是 提供乳酸菌菌种 。 3 .制作传统发酵食品——果酒和果醋的制作 (1)影响酵母菌生长、繁殖和发酵的主要环境因素：最适生长温度约为 28 ℃ 酿酒酵母的 氧气充足 的情况下，大量繁殖， 无氧 条件下，进行酒精发酵。 (2)影响醋酸菌生长、繁殖和发酵的主要环境因素：最适生长温度为 30～35 ℃， 有 氧。 (3)在果酒制作过程中，每隔 12 h 左右将瓶盖拧松一次的原因是因为发酵过程中会产生 CO2 ，因此要及时排气，以防止发酵瓶爆裂。 4．果酒、果醋制作中发酵装置图中各结构的作用 装置图 结构 作用 ① 醋酸发酵时连接充气泵，输入 充足无 充气口 菌空气 ； ② 制果酒时 关闭 充气口 排气口 用来排出 CO2 长而弯曲 的胶管 出料口 防止空气中微生物的污染 便于取料，及时监测发酵进行的情况 第一章 第 2 节 一 微生物的基本培养技术 防止_____ 杂菌污染 _______，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前 提，也是发酵工程的重要基础。 实验室培养微生物的条件：①要为人们需要的微生物提供合适的__营养____和___环境 ___条件；②要确保_____其他微生物__无法混入，并将__需要的微生物_分离出来。 一、培养基的配杂菌污染置 1.培养基的概念和类型 （1）概念：人们按照微生物对____营养物质__的不同需求，配制出供其_生长繁殖的 营养基质，即培养基。 （2）培养基的作用：用以培养、分离、_鉴定_、保存微生物或__积累___其代谢物。 （3）培养基的类型 标准 培养基种类 培养基特点 作用 微生物的分离与鉴定，活菌 固体培养基 加凝固剂，如琼脂 计数，保藏菌种 物理 容器放倒不致流出，剧烈震动则破 性质 半固体培养基 观察微生物运动、分类鉴定 散 液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产 选择培养基 根据某微生物的特殊营养要求配置 选择分离 功能 加入能与目的菌的代谢产物发生显 鉴别培养基 鉴定 色反应的指示剂 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 成分 天然培养基 来源 合成培养基 用已知的化学物质配制 分类鉴定 2.培养基的配制 （1）基本成分：水、碳源、氮源、无机盐 （2）特殊需求：某些微生物对___pH___、特殊营养物质以及__O2____的需求。 特殊营养物质：维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含 有）。 二、无菌技术 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染_。无菌技术主要包括__消毒_和_灭 菌。 1.消毒：指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生 物。 常用的消毒方法： ① 煮沸消毒法：100℃煮沸 5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢_。 ② 巴氏消毒 法：适合一些_不耐高温__的液体，如牛奶。 ③ 化学药剂消毒 法：用 70%酒精 擦拭双手、用__氯气消毒水源等。 ④ 紫外线消毒 法：接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用 紫外线 照射 30min。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。 2.灭菌：指使用强烈_的理化方法杀死物体内外所有_的微生物，包括_芽孢_和_孢子。 常用的灭菌方法： ① 湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或__高压蒸汽_（效果最好）进行灭菌的方法。常 用于__培养基__、无菌水等的灭菌。 ② 干热灭 菌：将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在 160～170℃的热空气中维 持 2～3h。常用于耐高温的_和需要保持干燥的物品（如玻璃器皿、金属用具等）。 ③ 灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如涂布器、_接种环、接种针或其它金属用具， 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容 易被污染的部位，也可以通过火焰 灼烧来灭菌。 三、微生物的纯培养 1.微生物的纯培养的概念：由__单一个体繁殖所获得的微生物群体称为 纯培养物，获 得_纯培养物_的过程就是纯培养。 2.微生物的纯培养步骤： （1）配置培养基；（2）灭菌；（3）接种；（4）分离和培养。 【探究·实践·酵母菌的纯培养】 1. 培养原理：微生物群分散或稀释→单个细胞→单个菌落。 菌落：分散的微生物在适宜的固体 培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定 形态结构_的子细胞群体 ，这就是菌落。 2.获得单菌落的方法：采用_平板划线_法和稀释涂布平板_法将单个微生物分散在固体 培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物_形成的纯培养物。 3.方法步骤 （1）制备培养基：配制培养基→灭菌→__倒平板 ____。 （2）接种和分离酵母菌：通过 接种环在固体培养基表面连续划线_的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散_到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到 单菌落。 （3）培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将_接种后的平板和一个未接种的平板（检测培养 基是否合格）倒置，放入 28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温 培养箱中培养 24～48h。平板倒置的目的：既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可 以 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 。 第一章 第 2 节 二 微生物的选择培养和计数 一、选择培养基：在微生物学中，将允许_特定种类_的微生物生长，同时抑制 或_阻止 其 他种类微生物生长的培养基。 二、微生物的选择培养 如果想知道 1g 土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需要对土样进行适当的处理以及 科学的测定微生物数量的方法——_稀释涂布平板法。 1.稀释涂布平板法：将菌液进行一系列 梯度稀释_，然后将不同稀释度的菌液分别涂 布到__固体_培养基的表面，进行培养。 基本操作：（1）梯度稀释_；（2）涂布平板 。 2.实验操作注意事项： ①10g 土样加入盛有 90mL 无菌水中后，已稀释 10 倍__，在计算时，不要忽略； ② 由于使用的是选择 培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些 微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证； ③ 过程中所有操作都应在_酒精灯火焰 旁进行； ④ 将涂布器从_酒精_中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼 烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 三、微生物的数量测定 1.间接计数法——_稀释涂布平板法 （1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品 稀释液中的_一个活菌_。通过统计平板上的菌落数_，就能推测出样品中大约含有多少活 菌。 （2）计数原则 ① 一般选择菌落数为 30～300 的平板计数。②在同一稀释度下，应至少对 3 个平板 进行重复计数，然后求出平均值。③适当的_稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的 关键。 （3）结果分析：①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少_；②统计结果一般用__菌落数 而不是用活菌数来表示。 原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是_ 一个菌落_。 2.直接计数法——_显微镜直接_计数 （1）原理：利用特定的_细菌 计数板或血细胞__计数板在显微镜下观察、计数，然后 再计算一定体积的样品中微生物的数量。 （2）缺点：统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。 第一章 第 3 节 发酵工程及其应用 一、发酵工程的基本环节 发酵工程一般包括 菌种的选育 ，扩大培养，培养基的配制、 灭菌 ，接种， 发酵 ， 产品分离、提纯等方面。 1．选育菌种：性状优良的菌种可以从 自然界 中筛选出来，也可以通过 诱变育种 或 基因工程育种 获得。 2．扩大培养：工业发酵罐的体积很大，接入的菌种总体积也较大，因此在发酵之前还需 要对菌种进行 扩大培养 。 3．配制培养基：菌种确定后，选择原料制备培养基。培养基的配方要经过反复试验才能 确定。 4．灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大 下降。因此， 培养基 和 发酵设备都必须经过严格的灭菌。 5．接种：扩大培养的菌种和灭菌后的 培养基 加入发酵罐中。大型发酵罐有计算机控制系 统，能对发酵过程的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和 控制。 6．发酵罐内发酵：在发酵过程中，要随时检测培养液中的 微生物数量 、 产物浓度 等， 以了解发酵进程。还要及时添加必需的 营养组分 ，要严格控制 温度 、 pH 和溶解氧 等发酵条件。 7．分离、提纯产物：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用 过滤 、 沉淀 等方法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当 的 提取 、分离 和纯化 措施来获得产品。 二、发酵工程的应用 1．在食品工业上的应用 (1)生产传统的发酵产品，如 酱油 (2)生产各种各样的食品添加剂，如通过 黑曲霉 发酵制得的柠檬酸，由 谷氨酸 棒状杆菌 发酵得到谷氨酸，制成味精。 (3)生产酶制