课时 3.发酵工程的无菌技术（二） 课标内容要求 核心素养 概述平板划线法和稀释涂布平 科学探究：通过平板划线法和稀释涂布平板法的学习， 板法是实验室进行微生物分离 学会对实验结果进行分析和评价。 和纯化的常用方法。 一、课前自主学习 和 1.接种微生物常用的方法有 接种环的目的是 2. 统计菌落数目可用的方法有 落数在 ；用平板划线法时，每次划线前都要灼烧 。 和 ；用后一种方法计数时，需选择菌 的平板进行计数。在同一稀释度下,应至少对 个平板进行重复计数,然后求 出平均值。 二、课内探究学习 探究活动一：平板划线法 根据教材中内容将下面主要步骤按正确的顺序排列起来： 讨论： 1．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 2．从防止杂菌污染的角度思考，培养基冷却凝固后将培养皿倒置的原因是什么？ 3．采用平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？ 4．在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 5．接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？ 6．接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未 接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？ 练一练： 1、如图表示酵母菌纯培养的部分操作步骤,下列有关叙述正确的是 (　　) A.步骤①操作时,待倒入的培养基冷却凝固后,盖上培养皿盖,将其倒置 B.步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧消毒,接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液 C.步骤③沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,最后一次的划线不能与第一次的相连 D.步骤④是将培养皿放在培养箱中培养,也需倒置,一段时间后所得到的都是酵母菌的菌 落 2、在酵母菌的纯培养实验中,划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示,且甲、乙的对应位置 不变。下列有关叙述错误的是(　　) A.配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌 B.甲中 a 区域为划线的起始位置 C.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落 D.图示实验过程中接种环灼烧了 5 次 探究活动二、稀释涂布平板法 1、梯度稀释 讨论：该操作需注意什么： 2、涂布平板 讨论： 下面是某兴趣小组对土壤中某种微生物的分离与计数的实验流程示意图。 （1）图示统计菌落数目的方法是什么?利用该法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,原 因是什么? （2）甲同学在稀释倍数为 106 的浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为 230,该同学的统 计结果是否真实可靠?为什么?乙同学在该浓度下涂布了 3 个平板,统计的菌落数分别为 21、212、256,该同学将 21 舍去,然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理?为 什么? （3）某同学在三种稀释度下吸取 0.1 mL 的菌液涂布平板,统计菌落数,得到以下的数据,试 计算 1 g 样品的活菌数。 平板 稀释度 平板 1 平板 2 平板 3 104 320 360 356 10 5 212 234 287 10 6 21 23 18 自我检测 3 班级 姓名 一、单选题 1.接种微生物的方法很多，平板划线法是最常用的一种。如图是平板 划线示意图，划线的顺序为①②③④。操作方法中错误的是(　　) A．划线操作时，将沾有菌种的接种环插入培养基 B．平板划线后培养微生物时要倒置 C．不能将第④区域的划线与第①区域的划线相连 D．在②～④区域中划线前后都要对接种环进行灭菌 2. 如图是倒平板的操作，下列相关叙述错误的是(　　) A．正确的操作顺序应该是丙→乙→甲→丁 B．甲在酒精灯火焰附近进行可以避免杂菌污染 C．丁操作必须要等待平板冷却凝固后才能进行 D．培养基应冷却到 50 ℃倒平板是由于该温度下不易受杂菌污染 3. 下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为 1→2→3→4→5。下列操作方法正确的是( ) A．操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌 B．划线操作应在火焰上进行 C．在 5 区域中才可以得到所需菌落 D．在 1、2、3、4、5 区域中划线前后都要对接种环灭菌 4.某同学在稀释倍数为 106 的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为 234 个，那么每毫升 样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为 0.1 mL)(　　) A．2.34×108 个 C．234 个 B．2.34×109 个 D．23.4 个 二、多选题 5.下列关于平板划线操作的叙述，错误的是(　　) A．每次划线前都要灼烧接种环 B．灼烧接种环后，要立即用接种环接种，防止杂菌污染接种环 C．要在酒精灯旁进行 D．接种前，要将菌种试管口通过火焰 6.下列有关平板划线法的操作，正确的是(　　) A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌 B．打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞 C．不能将最后一次的划线与第一次的划线相连 D．最后将平板倒置，放入恒温培养箱中培养 7.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是 (　　) A．4 号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是 5 号试管中的 10 倍 B．5 号试管中稀释液进行平板培养的结果表明每克该土壤中的菌株数目为 1.7×106 个 C．当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌 D．某一稀释度下至少涂 3 个平板，该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数 目高 三、非选题 8.下图甲、乙是微生物接种常用的两种方式，回答相关问题： (1)图甲是利用____________法进行微生物接种的，图乙是利用________________法进行微 生物接种的。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具 进行灭菌和消毒的方法依次是____________和酒精消毒。 (2)平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从____ ____________________开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线_____ ___。 (3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？___________________________。 (4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)所示方法。 (5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？ __________________________________________。 9.豆浆是深受中国百姓喜爱的饮品,但易变质,保质期较短。科研人员对变质豆浆中的腐败 细菌进行分离,并研究了乳酸链球菌素对腐败细菌的抑制效果,为生产豆浆时优化保质方法 提供依据。主要研究过程如下: ① 豆浆变质处理:将 2 种市售豆浆 A、B 和自制豆浆在无菌操作台上分别装入已灭菌的 250 mL 三角瓶中,密封、37 ℃条件下放置 7 d 后,豆浆发生变质。 ② 腐败细菌的初步分离和计数:取变质的豆浆在无菌条件下接种到细菌培养基上,培养一 段时间后,统计各培养基上菌落种类和数量。结果如表: 菌落数/个 细 自 菌 菌落特征 序 菌落直 径/mm 豆浆 A 豆浆 B 号 制 豆 浆 S1 S2 S3 表面有白色绒毛,圆形边缘不 规则 白色,表面无绒毛,有白色液 滴 黄色,表面无绒毛,如同黄色 液斑 5 5 3 7 1～2 18 11 24 20～30 11 7 15 ③ 比较乳酸链球菌素添加量对腐败细菌的抑制效果:以自制的新鲜豆浆为材料,经相应处 理后,在 37 ℃条件下放置 35 d 后,统计豆浆中腐败细菌数量,结果如图。 请回答下列问题。 (1)步骤①中三角瓶的常用灭菌方法是　　　　,步骤②中培养基的常用灭菌方法是　 　。 (2)步骤②中区分菌落种类的依据是　　　　　　　　　　　　　。统计菌落种类和数量时 要每隔 24 h 观察统计一次,直到各类菌落数目稳定,以防止　　　　　　　　　　　　　。 (3)乳酸链球菌素是一种天然食品防腐剂,它是由 34 个氨基酸组成的多肽。步骤③结果表明, 最能耐受乳酸链球菌素的细菌是　　 ;为有效防止豆浆腐败,在生产中乳酸链球菌素的添 加量应控制在　　　　 左右。 (4)为了解乳酸链球菌素对细菌的作用方式是抑制细菌生长、溶菌性杀死细菌(细胞破裂)还 是非溶菌性杀死细菌,科研人员将乳酸链球菌素加入细菌菌液中,随着发酵时间的延长,检测 细菌的活菌数、除去菌体的上清液中核酸含量,实验结果如图所示。以上实验表明乳酸链球 菌素对细菌的作用方式为　　　　　　　　,理由是　 　 ； 。 (5)乳酸链球菌素作为天然防腐剂,但不会改变人体肠道中的正常菌群,也不会进入内环境, 推测可能的原因是 　 。 参考答案 自主学习 1、平板划线法 稀释涂布平板法 防止接种环上的微生物污染培养基 2、显微镜直接计数 稀释涂布平板法 30-300 个 3 合作探究一 baefcgd 1．对瓶口进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 2．培养基冷却凝固后，培养皿的皿盖上会凝结水珠，将培养皿倒置，可以防止皿盖 上的水珠落入培养基造成污染。 3． (1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。 (2)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。 (3)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内，划线 后及时盖上皿盖。 (4)每次划线结束后，灼烧接种环，冷却后再进行下一次划线。 (5)整个接种过程要在酒精灯火焰旁进行。 4．划线末端含有的菌体数目较少，每次从上一次划线的末端开始划线能够使菌体的 数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的菌体。 5．划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。划线结束后灼烧，能及时杀 死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。 6．培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温 1～2 d 后无菌 落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基 被污染了，需要重新制备。 探究活动二 1、每支试管及其中的 9 mL 水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰 1～2 cm 处。 2、（1）稀释涂布平板法;当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。 （2）不真实,为增加实验的说服力与准确性,应设置重复实验,在同一稀释度下至少涂布 3 个平板,统计结果后计算平均值。不合理,应分析实验过程中可能的影响因素,找出差异的原 因,而不能简单地舍弃后进行计数。 （3）105 的稀释度下取 0.1 mL 菌液涂