考点 51 植物有效成分的提取 高考频度：★★★☆☆ 难易程度：★★★☆☆ 1．基因工程的概念 （1）供体：提供目的基因。 （2）操作环境：体外。 （3）操作水平：分子水平。 （4）原理：基因重组。 （5）受体：表达目的基因。 （6）本质：性状在受体体内的表达。 （7）优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。 2．DNA 重组技术的基本工具 （1）限制性核酸内切酶(简称：限制酶) ① 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ② 作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ③ 结果：产生黏性末端或平末端。 （2）DNA 连接酶 ① 种类：按来源可分为 E·coli DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶。 ② 作用：将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ③DNA 连接酶和限制酶的关系 （3）载体 ① 种类：质粒、λ 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 ② 质粒的特点 3．PCR 原理 （1）细胞内 DNA 复制条件 条件 组分 作用 模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 原料 [来源:学§科§网 Z§X§X§K] 四种脱氧核苷酸 解旋酶 合成 DNA 子链的原料 打开 DNA 双螺旋 xxk.Com][来源:学科 酶 DNA 聚合酶 能量 Z 引物 RNA ATP 催化合成 DNA 子链 为解螺旋和合成子链供能 为 DNA 聚合酶提供合成的 3’端起点 （2）细胞内 DNA 复制过程 ①DNA 的两条链是反向平行的，通常将 DNA 的羟基末端称为 3’端，而磷酸基团的末端称为 5’端。 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3’端延伸 DNA 链，因此，DNA 复制需要引物。 DNA 的合成方向总是从子链的 5’端向 3’端延伸。 ②在 DNA 的复制过程中，复制的前提是双链解开。在体外可通过控制温度来实现。在 80~100 ℃ 的温度范围内，DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于 PCR 过程的温度高，导致 DNA 聚合酶失活，后来耐高温的 DNA 聚合酶的发现和应用，大大增加了 PCR 的效率。 ③PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供：DNA 模板，分别与两条模板链相结合的两种 引物，四种脱氧核苷酸，耐热的 DNA 聚合酶，同时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。 4．PCR 的反应过程 PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一 次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的 DNA 单链会与引物Ⅱ结合，进行 DNA 的延伸，这样，DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的序列成 指数扩增。 5．实验操作 （1）PCR 反应体系：缓冲液、DNA 模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定的 DNA 聚合酶、两种 RNA 引物、水。 （2）实验操作步骤 ① 按照 PCR 反应体系配方配制反应液； ② 将 PCR 反应体系 50μL 用微量移液器转移到微量离心管（0.5 mL）中； ③ 将微量离心管放到 PCR 仪中； ④ 设置 PCR 仪的工作参数； ⑤DNA 在 PCR 仪中大量扩增。 6．基因工程的操作过程与应用 （1）基因工程的操作步骤 （2）基因工程的应用：培育转基因植物和转基因动物，生产基因工程药物，进行基因治疗。 （3）目的基因导入不同受体细胞的过程 生物种类 常用方法 受体细胞 转化过程 植物 农杆菌转化法 体细胞或受精卵 将目的基因插入到 Ti 质 动物 显微注射技术 受精卵 将含有目的基因的表 微生物 感受态细胞法 原核细胞 Ca2＋处理细胞→感受态细 粒的 TDNA 上→农杆菌 达载体提纯→取卵(受 胞→重组表达载体 DNA →导入植物细胞→整合 精卵)→显微注射→受 分子与感受态细胞混合→ 到受体细胞染色体的 精卵发育→获得具有 感受态细胞吸收 DNA 分 新性状的动物 子 DNA 上→表达 （4）基因治疗与基因诊断的不同点 基因治疗 原理 基因表达 操作过程 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞 进展 临床实验 基因诊断 碱基互补配对 中，以表达出正常性状来治疗(疾病) 制作特定 DNA 探针与病人样品 DNA 混合，分析杂交带情况 临床应用 7．蛋白质工程 （1）流程图 写出流程图中字母代表的含义： A．转录，B．翻译，C．分子设计，D．多肽链，E．预期功能。 （2）结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。 （3）应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。 考向一 限制性核酸内切酶、DNA 连接酶等酶的作用 1．如图为 DNA 分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶、 解旋酶作用的正确顺序是 A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③② 【答案】C 【解析】限制酶可在特定位点对 DNA 分子进行切割；DNA 聚合酶在 DNA 分子复制时将脱氧核苷酸连接 成 脱氧核苷酸链；DNA 连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起；解旋酶的作用是将 DNA 双链解开 螺旋，为复制或转录提供模板。 解题技巧 确定限制酶的种类 （1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ① 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 PstⅠ。 ② 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 SmaⅠ。 ③ 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如 图甲也可选择用 PstⅠ 和 EcoRⅠ 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 （2）根据质粒的特点确定限制酶的种类 ① 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ② 质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制 酶 SmaⅠ 会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢 失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 2．若要利用某目的基因(见图甲)和 P1 噬菌体载体(见图乙)构建重组 DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶 切位点分别是 BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和 Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是 A．用 EcoRⅠ 切割目的基因和 P1 噬菌体载体 B．用 BglⅡ 和 EcoRⅠ 切割目的基因和 P1 噬菌体载体 C．用 BglⅡ 和 Sau3AⅠ 切割目的基因和 P1 噬菌体载体 D．用 EcoRⅠ 和 Sau3AⅠ 切割目的基因和 P1 噬菌体载体 【答案】D 【解析】解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用 EcoRⅠ 和 Sau3AⅠ 切割目的基因 和 P1 噬菌体载体，构建的重组 DNA 中 RNA 聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。 考向二 载体的作用及特点分析 3．下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是 A．常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等 B．目的基因与载体结合的过程发生在细胞外 C．载体上含有标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞 D．质粒可作为基因工程的载体，其化学本质是小型链状 DNA 【答案】D 【解析】基因工程常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，A 正确；基因工程的操作环境是在生物 体外，因此目的基因与载体结合的过程发生在细胞外，B 正确；载体上含有标记基因，其作用是检测目 的基因是否导入受体细胞，C 正确；质粒的化学本质是小型环状 DNA 分子，D 错误。 技法提炼 载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗 生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示： 4．如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的 A 处，则切割基因时可用的是 A．HindⅢ B．EcoRⅠ C．EcoB D．PstⅠ 【答案】C 【解析】A 处有 BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ 限制酶的切点，使用 A～D 中的 EcoB 切割时，才能让目的基因插入 到 A 处。 考向三 PCR 的反应过程 5．聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。PCR 过程一般经历下述 30 多次循环：95 ℃下使模板 DNA 变性、解链→55 ℃下复性(引物与 DNA 模板链结合)→72 ℃下引物链延伸(形成新的 脱氧核苷酸链)。下列有关 PCR 过程的叙述中不正确的是 A．变性过程中破坏的是 DNA 分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现 B．复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要 DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D．PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需酶的最适温度较高 【答案】C 【解析】变性过程中破坏的是 DNA 分子内碱基对之间的氢键，解旋酶也具有该作用，A 正确。复性过程 中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，B 正确。延伸是合成 DNA 的过程，所以该 过程中需要 DNA 聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸，C 错误。PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需酶的最 适温度较高，因为 PCR 过程需要高温变性，即使在复性时的温度也比较高，D 正确。 6．利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA 复制类似（如下图所示）。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是 A．用 PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连 C．退火温度过高可能导致 PCR 反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为 15/16 【答案】D 【解析】用 PCR 方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 （两种），但不必知道基因的全部序列，A 正确；设计引物时，需要避免引物之间形成碱基互补配对而造 成引物自连，B 正确；退火的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条 DNA 单