考点 29　基因工程、蛋白质工程和细胞工程 1．基因工程常考的 3 种基本工具 (1)限制性核酸内切酶：识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割 DNA 分子。 (2)DNA 连接酶：① E·coli DNA 连接酶只能连接黏性末端；② T4 DNA 连接酶能连接黏性末 端和平末端。 (3)载体：①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制。②有一个至多个限制酶切割位点，供外 源 DNA 片段(基因)插入其中。③具有特殊的标记基因——以便对含目的基因的受体细胞进 行鉴定和选择。 2．基因工程的 4 大操作程序 (1)目的基因的获取：①从基因文库中获取。 ② 利用 PCR 技术扩增：a.原理：DNA 双链复制。b.条件：模板 DNA、引物、游离的脱氧 核苷酸、热稳定的 DNA 聚合酶。 ③ 用化学方法直接人工合成。 (2)基因表达载体的构建 ① 基因表达载体模式图 ② 基因表达载体的构建过程 (3)将目的基因导入受体细胞 ① 导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。 ② 导入动物细胞：显微注射技术。 ③ 导入微生物细胞：感受态细胞法(用 Ca2＋处理)。 (4)目的基因的检测与鉴定 ① 插入检测：DNA 分子杂交技术。 ② 转录检测：DNA—RNA 分子杂交技术。 ③ 翻译检测：抗原—抗体杂交。 ④ 个体水平检测：抗性接种实验。 3．图解记忆蛋白质工程 4．比较记忆植物组织培养与动物细胞培养 项目 植物组织培养 取材 植物幼嫩部位 动物细胞培养 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器 官或组织 过程 结果 获得植株个体，可以体现全能性 条件 ① 无菌；②营养；③适宜条件 新的细胞，不形成个体，不体现全能 性 ① 无菌、无毒；②营养、血清等；③ 温度和 pH；④气体环境：O2、CO2 5.植物体细胞杂交与单克隆抗体制备过程比较 步骤 第一步 植物体细胞杂交过程 原生质体的制备(酶解法) 第二步 原生质体融合(物理、化学法) 单克隆抗体制备过程 正常小鼠免疫处理 动物细胞融合(物理、化学、 第三步 第四步 生物方法) 杂种植株的筛选与培养 杂交瘤细胞的筛选与培养 杂种植株的诱导与鉴定 单克隆抗体的提纯 ① 两种技术手段的培养过程中都进行有丝分裂，都是无性繁殖，都可 相同点 称为克隆，都不涉及减数分裂；②均为无菌操作，需要适宜的温度、 pH 等条件 (1)诱导融合的方法分别有哪些？融合的细胞类型有哪几种(仅考虑两两融合的细胞)? 提示　①诱导植物体细胞的原生质体融合的方法主要有离心、振动、电激或用聚乙二醇 (PEG)作为诱导剂。 ② 动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(诱导动物细胞融合的特有 因素)、电激等。 融合的细胞类型：前者—AA、BB、AB。后者—瘤瘤、B 瘤、BB。 (2)各自的原理分别有哪些？ 提示　前者有细胞膜的流动性和植物细胞的全能性，后者有细胞膜的流动性和细胞增殖。 6．掌握克隆动物培育的流程 7．理清单克隆抗体制备的过程 题组一　基因工程和蛋白质工程 1．乙型脑炎和伪狂犬病是猪的两种常见传染病。如图是利用基因工程技术生产能同时预防 这两种病疫苗的流程图，其中 PrM 为乙型脑炎的特异性抗原基因，PK、gG、gD 为伪狂犬 病的主要抗原基因，TK 为伪狂犬病的毒性基因，pgG 为启动子，BamHⅠ 和 EcoRⅠ 为两种限 制酶，其识别序列及切割位点分别是 G↓GATCC、G↓AATTC。请回答下列问题： (1)过程①所需的酶有____________和____________。下列四种引物中适用于过程①的一对 引物是________。 P1：5′TTGGATCCATGGAAGGCTCAATCATGTG 3′ P2：5′CACAAGCTTAGATGACGTATCCAAGGAG 3′ P3：5′TACGGTACCTTAGGGGTTAAGTGGG 3′ P4：5′GCGAATTCTAACTGTAAGCCGGAGCG 3′ (2)过程②所需的酶有__________________________。过程③中要用 Ca2＋处理大肠杆菌，其 目的是________________________________________。 (3)重组伪狂犬病毒中不带 TK 基因的优点是________________________________。 (4)将获得的病毒疫苗注射到猪体内，一方面病毒中抗原基因在猪细胞中大量表达，诱导猪 获得______________免疫；另一方面__________________________________使得病毒疫苗 具有用量小、作用更持久等优点。 答案　(1)反(逆)转录酶　耐高温的 DNA 聚合酶(或 Taq 酶)　P1 和 P4　(2)限制酶和 DNA 连 接酶　使大肠杆菌成为感受态细胞，有利于外源 DNA 的导入　(3)不具毒性，注射后不会 引发猪患病　(4)体液免疫和细胞(或特异性)　病毒在动物体内可增殖并长期保留 解析　(1)图中过程①表示乙脑病毒的 RNA 经反(逆)转录形成相应的目的基因，并通过 PCR 技术扩增该目的基因的过程，该过程涉及逆转录和 PCR 技术，因此需要逆转录酶和耐高温 的 DNA 聚合酶(Taq 酶)的催化。图中目的基因两侧是限制酶(BamHⅠ 和 EcoRⅠ)的识别序列， 故应该选择的引物是 P1 和 P4。(2)图中过程②表示构建基因表达载体，需要的工具酶有限 制酶和 DNA 连接酶。过程③表示将重组 DNA 导入受体细胞(大肠杆菌)的过程，用 Ca2＋处 理大肠杆菌使其成为感受态细胞，有利于外源 DNA 的导入。(3)TK 为伪狂犬病的毒性基因， 因此重组伪狂犬病毒中不带 TK 基因的优点是不具毒性，注射后不会引发猪患病。(4)将获 得的病毒疫苗注射到猪体内，一方面病毒中抗原基因在猪细胞中大量表达，诱导猪获得特 异性免疫(体液免疫和细胞免疫)；另一方面由于病毒在动物体内可增殖并长期保留，使得 病毒疫苗具有用量小、作用更持久等优点。 2．为研究肝癌致病机理，科研工作者利用如图所示的差异杂交法和基因工程获取相关癌基 因以作进一步研究。请据图回答问题： (1)图 1 中，A 过程需要用________酶，D 过程需要回收________(填“未杂交”或“杂交分子”) 的含 32P 的 cDNA 单链，继而通过人工合成，获得____________，并用其构建基因文库。 (2)从图 1 构建的基因文库中获取的目的基因，一般还需进行人工改造后才能用于基因表达 载体的构建，改造内容除了在基因两端添加限制酶的识别序列外，还需添加_____________ _______，以便其随载体导入受体细胞后，能正常调控表达过程。 (3)图 2 为改造后的目的基因。图 3 为两种质粒，其中 Ampr 为氨苄青霉素抗性基因，Tetr 为 四环素抗性基因，lacZ 为蓝色显色基因，其表达产物可使底物 XGal 呈蓝色。EcoRⅠ(0.7 kb)、NotⅠ(1.2 kb)等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离(1 kb＝1 000 个碱基对)。 ① 图 3 中能作为载体的最理想的质粒是________(填“X”或“Y”)，用选定的质粒与图 2 的目 的基因构建基因表达载体时，应选用的限制酶是______________。为筛选出成功导入目的 基因的受体细胞，培养基中应适量添加________________。 ② 若用 EcoRⅠ 完全酶切上述①中获得的重组质粒，并进行电泳观察，可出现四种长度不同 的片段，其长度分别为 1.7 kb、5.3 kb、________________。 答案　(1)逆转录　未杂交　双链 cDNA　(2)启动子和终止子　(3)①X　NotⅠ　四环素和 XGal　② 3.1 kb 和 3.9 kb 解析　(1)图 1 中，A 过程是以 mRNA 为模板通过逆转录合成 cDNA 单链的过程，该过程需 要用到的酶是逆转录酶。由于正常肝细胞总 mRNA 群中不含癌基因 mRNA，不能与以癌基 因 mRNA 为模板合成的 cDNA 单链完成分子杂交，因此，要获取癌基因应回收未杂交的 cDNA 单链，继而通过人工合成，获得双链 cDNA(癌基因)，并用其构建基因文库。(2)基因 正常表达需要启动子和终止子的调控，而人工合成的目的基因 (癌基因)中不含启动子和终 止子，因此在对获得的目的基因进行人工改造时需添加启动子和终止子。(3)① 根据图 2 可 知，目的基因中间含有 EcoRⅠ 酶切割位点，两端具有 NotⅠ 酶切割位点，因此只能用 NotⅠ 酶 切割目的基因而不能用 EcoRⅠ 酶切割，否则会破坏目的基因。分析质粒 X 和质粒 Y 的结构 可知，质粒 Y 的复制原点中含有 NotⅠ 酶切割位点，因此不能用质粒 Y 作为载体。因此，图 3 中能作为载体的最理想的质粒是 X，应选用的限制酶是 NotⅠ。由于质粒 X 中含有四环素 抗性基因 Tetr，因此，用含有四环素的培养基可筛选出导入了普通质粒(不含目的基因)和重 组质粒(含目的基因)的受体细胞；由于 NotⅠ 酶切会破坏质粒 X 中的蓝色显色基因 lacZ，因 此，用含有 XGal 的培养基可鉴别导入的是普通质粒还是重组质粒：培养结果呈蓝色说明 导入的是普通质粒，培养结果不呈蓝色说明导入的是重组质粒。综上所述，为筛选出成功 导入目的基因的受体细胞，培养基中应适量添加四环素和 XGal。②构建重组质粒时，只使 用一种限制酶，则目的基因可以以两种不同方向连接到质粒 X 被切开的切口中。由于目的 基因和质粒中均含有 1 个 EcoRⅠ 酶切割位点，因此每种重组质粒中含有 2 个 EcoRⅠ 酶切割 位点，若用 EcoRⅠ 完全酶切获得的每个重组质粒，都将得到 2 种不同长度的 DNA 片段，最 终可出现四种长度的 DNA 片段，长度分别为 1.7 kb、5.3 kb、3.1 kb 和 3.9 kb。 3．干扰素是用于治疗病毒感染和癌症的免疫活性蛋白质，若人的干扰素基因在大肠杆菌内 表达，产生的抗病毒性较低且保存困难，若将第 17 位的半胱氨酸改造为丝氨酸，则生产出 的干扰素的抗病毒性是原来的 100 倍，且可在－70 ℃条件下保存半年，下图是构建干扰素 工程菌的过程示意图。回答下列问题： (1)要改变干扰素的功能，可以考虑对干扰素的________进行改造。对干扰素进行改造，也 可直接对干扰素基因进行改造，其原因是_________________________________________ ____________________________________________________