考点 47 微生物的培养和应用 高考频度：★★★☆☆ 难易程度：★★★☆☆ 1．培养基 （1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 （2）营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对 pH、氧气以及 特殊营养物质的要求。 （3）种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。 2．无菌技术 （1）含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 （2）关键：防止外来杂菌的入侵。 （3）不同对象的无菌操作方法(连线) 3．大肠杆菌的纯化培养 （1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 ① 操作步骤 →→→→ ② 倒平板的方法及注意事项 a．请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。 b．甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。 c．丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。 （2）纯化大肠杆菌的方法 ① 纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较 纯的菌种。 ② 纯化大肠杆菌的关键步骤是接种。 ③ 常用的微生物接种方法有两种 a．平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀 释分散到培养基的表面。 b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的 梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到 琼脂固体培养基的表面，进行培养。 系列稀释操作(如图所示)： 涂布平板操作(如图所示)： （3）菌种的保存方法 ① 对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。 ② 对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。 4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （1）分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成 无机物的过程中起到催化作用。 （2）统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。 （3）实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。 5．分解纤维素的微生物的分离 （1）纤维素酶 ① 组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C1 酶、CX 酶和葡萄糖苷酶。 ② 作用 纤维素纤维二糖葡萄糖 （2）纤维素分解菌的筛选 ① 原理 ② 筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 ③ 培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。 ④ 实验流程 考向一 培养基及其制备方法分析 1．下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是 K2HPO4 成分 蛋白胨 葡萄糖 伊红 美蓝 蒸馏水 10 g 10 g 2g 0.4 g 0.065 g 1 000 mL 含量 A．从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基 B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨 C．该培养基缺少提供生长因子的物质 D．该培养基调节合适的 pH 后就可以接种使用 【答案】B 【解析】分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但 存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A 项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是 碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B 项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某 些物质可以看作是生长因子，C 项错误；培养基调节完 pH 还要进行灭菌等操作后，才能使用，D 项错 误。 解题必备 1．培养基的配制原则 （1）目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。 （2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。 （3）pH 要适宜：细菌为 6.5～7.5，放线菌为 7.5～8.5，真菌为 5.0～6.0，培养不同微生物所需 pH 不同。 2．微生物对主要营养物质的需求特点 不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。 （1）自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的 CO2，氮源可由含氮无机盐提 供。 （2）异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有 机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。 2．如下表所示为培养某种微生物的培养基的配方，请回答： 成分 NaNO3 K2HPO4 MgSO4·7H2O FeSO4 (CH2O) 琼脂 H2 O 含量 3g 1.5 g 0.5 g 0.01 g 30 g 10 g 1 000 mL （1）依物理性质，该培养基属于__________培养基。 （2）根据培养基原料，所培养微生物的同化作用类型是_________。 （3）该培养基中的碳源是__________。 （4）不论何种培养基，在配好之后倒平板之前都要先进行的_________；倒平板时，一般需冷却至___ _____左右，并在___________________操作。 （5）若用该培养基培养分解尿素的细菌，应除去物质____________，并加入物质________ 【答案】（1）固体 （2）异养型 （3）(CH2O)（4）灭菌 50 ℃ 酒精灯附近 （5）NaNO3 尿素 【解析】（1）该培养基的配制使用了凝固剂琼脂，依物理性质属于固体培养基。（2）根据题目所给 的培养基配方，所培养微生物生长所需的碳源是有机碳源(CH2O)可推知，其同化作用类型是异养型。 （3）根据培养基的配方，该培养基中的碳源是(CH2O)。（4）培养基在配好之后倒平板之前，都要先 灭菌，防止杂菌污染；倒平板时温度以触摸装有培养基的锥形瓶刚刚不烫手为宜，即需冷却至 50 ℃左 右；为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（5）若用该培养基培养分 解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，故除去物质 NaNO3，并加入物质尿素。 考向二 无菌技术的操作 3．无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中正确的是 A．紫外线照射前，适量喷洒石碳酸等消毒液，可以加强消毒效果 B．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖 C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 D．在微生物接种的实验中，用 95%酒精对实验者的双手和超净工作台进行消毒 【答案】A 【解析】用紫外线照射 30 min，可以杀死物体表面或空气中的微生物，在照射前，适量喷洒石碳酸等消毒 液，可以加强消毒效果，A 正确；高压灭菌加热结束时，待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打 开放气阀使压力表指针回到零，B 错误；为了防止污染，接种环经火焰灭菌、冷却后才可以快速挑取菌落， C 错误；在微生物接种的实验中，一般用 75%酒精对实验者的双手进行消毒，用紫外线照射 30 min 对超净 工作台进行灭菌，D 错误。 解题技巧 消毒和灭菌的辨析 项目 消毒 条件 较为温和的 结果 仅杀死物体表面或 物理或化学 内部的部分对人体 常用方法 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消 应用范围 日常用品 不耐高温的液体 用酒精擦拭双手，用 方法 灭菌 强烈的理化 因素 的微生物，包括芽 毒法 灼烧灭菌法 干热灭菌法 高压蒸汽灭 孢和孢子 菌法 有害的微生物 杀死物体内外所有 氯气消毒水源 接种工具 玻璃器皿、金属工具 培养基及容器的灭菌 4．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪 些部位的杂菌 A．接种环、手、培养基 B．高压锅、手、接种环 C．培养基、手、接种环 D．接种环、手、高压锅 【答案】C 【解析】灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等 都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害， 如操作者的手和衣着需要消毒处理。高压蒸汽通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种 方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。 考向三 大肠杆菌的纯化方法及过程分析 5．下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。 下列叙述中错误的是 A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液 B．对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为 102，则所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁 殖而成 C．乙培养皿中所得的菌落都符合要求 D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端 【答案】C 【解析】灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A 正确。稀释倍数过低会导致多个 菌体聚集在一起繁殖成菌落，B 正确。平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细 胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C 错误。连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起 点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞 或孢子繁殖而成，D 正确。 归纳整合 两种纯化细菌方法的比较 项目 平板划线法 优点 可以观察菌落特征， 对混合菌进行分离 缺点 适用范围 不能计数 适用于好氧菌 吸收量较少， 稀释涂布平板法 可以计数，可以观察 较麻烦，平板 适用于厌氧菌和兼性 菌落特征 不干燥效果不 厌氧菌 好，容易蔓延 6．下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题。 （1）图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用__________________法进行微生物接种。这 两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法 依次是________和酒精消毒。 （2）接种操作为什么一定要在火焰附近进行？________________________________________________。 （3）接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？________________________________。 （4）如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)。 【答案】（1）平板划线　 稀释涂布平板　 接种环　 涂布器　 灼烧灭菌（2）火焰附近存在着无菌区域 （3）避免培养过程产生的水分影响微生物的生长 （4）图乙 【解析】（1）图甲和图乙分别是平板划线法和稀释涂布平板法，这两种方法所用的接种工具分别是接种 环和涂布器。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。（2）由于在酒精灯 火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。（3）在微生物培养过程中会产生水，对微生物 的生长造成影响，故需要倒置培养。（4）由图可知，图示接种方法是稀释涂布平板法。 考向四 选择培养基成分及配制方