第 2 节 动物细胞工程 一、教学目标 （1）阐明动物细胞培养的条件和过程。 （2）简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。 （3）阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程，认同单克隆抗体在 临床上有重要的应用价值。 （4）阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景。 二、教学重点 （1）动物细胞培养的条件和过程。 （2）干细胞和生物医学工程中的应用。 （3）单克隆抗体的制备和应用。 （4）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 三、教学难点 （1）单克隆抗体的制备过程。 （2）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 四、课时安排 5 课时 五、教学过程 （一）新课导入 同学们，前面我们学习了植物细胞工程，先来回忆一下，植物细胞工程的 基本技术有什么？（植物组织培养技术和植物体细胞杂交技术），那么植物组 织培养的理论基础或者原理是什么？（植物细胞的全能性），植物体细胞杂交 的流程是什么？（酶解法去壁形成原生质体，诱导融合形成杂种细胞，再生出 细胞壁代表融合完成，然后经过脱分化、再分化过程形成杂种植株）。 今天让我们一起来学习动物细胞工程及其常用的技术，先来思考一个问题 ： 对于大面积烧伤的病人来说，急需进行健康的皮肤移植，那么这样皮肤可以来 自哪里呢？ 有同学说，可以将该病人自己其他部位的健康皮肤移植到烧伤部位，但是 自身的健康皮肤非常有限，也有的同学说，可以移植其他人的健康皮肤，但这 不仅来源不足，还会发生免疫排斥反应，那我们能不能用该病人的健康皮肤进 行体外培养、扩增，形成如图所示的人造皮肤，这样再移植回去，不就没有免 疫排斥反应了吗？ 事实上，科学家已经做过这样的实验，并且已经获得了成功，目前，科学 家正在研究对皮肤干细胞进行培养，以期获得适合临床上应用的人造皮肤，从 而提高烧伤病人皮肤移植的成功率，那么科学家所利用的关键技术就是动物细 胞培养，下面我们来了解一下怎样在体外进行动物细胞培养。 （二）讲授新课 一、动物细胞培养 动物细胞工程包括三大常用技术：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核 移植，其中，动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 先找同学给念一下它的概念 1）概念： 是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培 养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 2）原理 细胞增殖（有丝分裂） 3）结果 获得数量更多的相同细胞或细胞产物（但不能获得完整动物个体。） 4）分散的原因 ① 成块组织中细胞与细胞靠在一起，会限制彼此的生长与增殖 ② 使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需的 O2 和营养供应 ③ 保证细胞内代谢物及时排出。 过渡：那么，既然要在体外培养动物细胞，就要提供适合细胞生长的条件， 这些条件越接近体内越好，那么大家回忆一下我们选择性必修 1 讲过的知识 提问：①以人为例，体内细胞生活在哪里？（内环境／细胞外液中） ② 内环境为生活于其中的细胞提供了什么样的条件呢？（营养条件如 糖类、氨基酸、无机盐、维生素等；其他环境条件如温度 37℃左右、 pH 7.35-7.45、渗透压 770kPa 等） 过渡：因此在体外培养动物细胞时，也要满足类似的条件。 1、动物细胞培养的条件 动物细胞培养所需的基本条件包括营养条件和其他条件 1）营养： 有机物：糖类（一般是葡萄糖）、氨基酸、维生素等 无机物：无机盐（包括大量元素、微量元素） 合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基 （合成培养基的化学成分是已知的，有别于天然培养基） 由于人们对细胞生长所需的营养物质尚未研究清楚，因此在使用合成培养基 时通常需要加入动物血清（10%－20%） 其他物质：动物血清（其中含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物 质） （血清指血液自然凝固，经离心沉淀后得到的上面淡黄色的液体，不含纤维 蛋白原） 动物细胞培养一般在液体培养基中进行，也叫培养液。 2）无菌、无毒的环境： 无菌：培养液和所有培养用具进行灭菌，也可在培养液中加入一些抗生素， 此外，需要在无菌环境下进行操作。这是因为适合动物细胞生长的培养液也适 合微生物的生长。 无毒：定期更换培养液，以清除细胞代谢物（细胞在动物体内产生的代谢物 可通过循环、泌尿系统等排出） 3）温度、pH 和渗透压： 温度：36.5±0.5℃ pH: 7.2-7.4 培养液呈暗红色：加入了 pH 指示剂，根据 pH 的改变而呈现不同的颜色，方 便培养细胞时进行判断 4）气体环境： O2：细胞代谢所需 CO2：维持培养液的 pH 培养皿或培养瓶均可透气 CO2 培养箱能释放：95%的空气（注意不是 O2）＋5%的 CO2，且湿度饱和 过渡：我们已经知道了动物细胞培养的条件，那么，培养过程是怎样的呢？下 面请同学们来阅读一下书上的介绍以及示意图，然后我们一起来总结培养过程。 2、动物细胞培养的过程 1）取样 动物胚胎或幼龄动物的器官或组织（分化程度低、分裂能力强、容易培养） 2）分散细胞 机械法或酶解法（先剪碎然后用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理），后一种常用 注意：控制好酶的浓度和处理时间，以免损伤细胞膜上的蛋白 提问：①用胰蛋白酶分散细胞说明细胞之间的主要物质是什么？（蛋白质） ② 用胃蛋白酶行吗？（胃蛋白酶的最适 pH 约为 2，大于 6 时失去活 性） 3）制备细胞悬液 向细胞分散好的培养皿中加入培养液，以终止胰蛋白酶的作用，使其形成细 胞悬液（血清发挥终止作用） 4）原代培养 体外培养细胞分为两类： ① 悬浮生长 ② 贴壁生长：大多数细胞属于此类，我们把细胞贴附于培养瓶瓶壁上的现象 称为细胞贴壁（单层细胞） 要求：培养皿（瓶）表面光滑、无毒、易于贴附 悬浮细胞因细胞密度大、有害代谢物积累、营养物质缺乏会停止分裂，而贴壁 细胞还会发生接触抑制，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常 停止分裂，这时就需要分瓶培养了。 5）传代培养 我们把动物组织经处理后的初次培养称为原代培养， 分瓶之后的培养称为传代培养。 不同细胞分瓶方法不同：悬浮细胞直接用离心法收集，然后用新的培养液制成 细胞悬液，贴壁细胞需要先用胰蛋白酶等处理，然后再离心收集制成细胞悬液。 此时胰蛋白酶等的作用是将细胞从瓶壁上脱离下来。这样就得到了大量动物细 胞。 提问：细胞能否一直进行传代培养？ 细胞分裂至 10 代以内，遗传物质是不会发生改变的，分裂 10 代以上，遗传物 质会逐渐发生改变，甚至变为癌细胞。 3、动物细胞培养与植物组织培养的异同点 4、干细胞培养及其应用 （1）干细胞：在一定条件下能分化成其他类型细胞的细胞（stem cell） （2）分布：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中 （3）分类：胚胎干细胞和成体干细胞等 1）胚胎干细胞（简称 ES 细胞）：存在于早期胚胎中，具有分化成为成年 动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体 的潜能。 ES 细胞的特点：体积小、细胞核大、核仁明显 ES 细胞的用途：①研究体外条件下细胞分化的机理；②体外诱导形成组织细 胞， 治疗组织损伤（如心肌细胞、神经元、造血干细胞）；③培育人造器官，用于 器 官移植。（选择性必修 1 的 84 页，2015 年利用干细胞培养出具有单个腔室 结构的迷你跳动心脏，是人心脏的千分之一） 2）成体干细胞：成体组织或器官内的干细胞 ① 分类：造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等 ② 分布：骨髓、外周血、脐带血、神经系统、睾丸中 ③ 作用：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完 整 个体的能力。（如造血干细胞只能分化为各种血细胞，而不能分化成别的细 胞） ④ 举例：造血干细胞移植治疗白血病或放疗后引起的造血系统功能障碍；利 用 神经干细胞治疗神经组织损伤和神经退行性疾病（帕金森病、阿尔茨海默 病） 干细胞按照功能进行分类：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞 3）诱导多能干细胞（简称 iPS 细胞） ① 胚胎干细胞的局限：必须从胚胎中获取，而且取出的胚胎最终会被遗弃， 涉及伦理问题 ② 定义：体外诱导成纤维细胞、已分化的 T 细胞、B 细胞等，获得类似胚胎 干细胞的一种细胞 ③ 诱导方法：将特定的基因、特定的蛋白或一些小分子化合物导入细胞中 ④ 过程：取病人成纤维细胞→转入相关因子→细胞转化为 iPS 细胞→诱导 iPS 细胞定向分化为多种组织细胞→移植回病人体内 ⑤ 优点：无需破坏胚胎；可以来自病人自身的体细胞，从而避免发生免疫排 斥反应。 因此，普遍认为 iPS 细胞的应用前景优于胚胎干细胞 4）干细胞研究风险 肿瘤发生（因为胚胎干细胞或 iPS 细胞诱导分化的细胞，无论在体外还是体 内，都具有较强的扩增能力） 5）实际应用： 假如有一位病人心肌细胞受损，需要进行移植，那么可以有什么样的办法呢？ ① 办法一：取患者的体细胞，注入去核卵母细胞中，构建重组胚胎，体外培 养分离出 ES 细胞，然后将 ES 细胞定向分化成特定类型的细胞。 ② 办法二：取患者的成纤维细胞等，转入相关因子，诱导其形成 iPS 细胞， 然后再诱导其分化成特定类型的细胞。 第 2 课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体 引入：先来回忆一下植物体细胞杂交的过程，说明，该技术可以突破不同植物 之间的生殖隔离，实现远缘杂交，从而培育新的作物类型，那么，能否利用相 同的原理将动物细胞进行融合呢？ 1、动物细胞融合技术 （1）概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术 （与植物体细胞杂交的区别：①无需去除细胞壁；②全能性受限制，不能培育 成新的动物个体） （2）原理：细胞膜的流动性 （3）融合方法：物理：离心法、电融合法 化学：PEG 融合法、高 Ca2+-高 pH 融合法 生物：灭活病毒诱导法 生物法介绍： ① 发现： ② 灭活：指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗 原结构 ③ 原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞 互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发 生融合。 （4）结果：形成杂交细胞（注意不是植物的杂种细胞）。即融合后形成的原 来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。 （5）过程：细胞膜融合→细胞质融合→细胞核融合 （6）意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、 动植物之间）成为可能。 （7）应用：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段 。 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。 2、单克隆抗体的制备 （1）体液免疫的过程 （2）传统抗体制备方法及缺陷： 将抗原反复注射到动物体内，刺激动物机体发生体液免疫和二次免疫，然后 从动物血清中提取所需抗体，但此方法不仅产量低（动物体内的 B 细胞或浆细 胞