动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术：  动物细胞培养  动物细胞融合  动物细胞核移植等 最基础的是 —— 动物细胞培养技术 河北峰峰第二中学 第 2 节 动物细胞工程 一 动物细胞培养 从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法 是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。 但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常 有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会 产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得 大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤 的单个细胞培养出可供移植的皮肤？ 通过细胞培养构建 的人造皮肤 可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培 养、扩增； 目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获 得适合临床上使用的人造皮肤； 一、动物细胞培养的概念 从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然 后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 原理：细胞增殖（有丝分裂） 地位：动物细胞工程的基础 二、动物细胞培养的条件 动物细胞培 养的条件 营养条件 其他条件 糖类、氨基酸、 无机盐、维生素 等 无菌、无毒的环 境 适宜的温度、 pH 和渗 透压 适宜的气体环境 1. 营养 （ 1 ）培养基构成： 合成培养基 ＋ 血清等一些天然成分 合成培养基： 将细胞所需的营养物质（糖类、氨基酸、无机盐 、维生素等）按种类和所需量严格配制的培养基。 血清等一些天然成分： 含有尚未研究清楚的细胞所需的营养物质 （ 2 ）培养基类型： 液体培养基 （培养液） 2. 无菌、无毒的环境 ① 对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。 ② 在无菌环境下进行操作。 ③ 培养液需要定期更换： 清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自 身造成危害。 3. 温度、 pH 和渗透压 （ 1 ）适宜的温度： 哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃ ___________ 为宜； （ 2 ）适宜的 pH 多数动物细胞生存的适宜 ： pH 为 7.2-7.4 ________ （ 3 ）适宜的渗透压： 目的 维持细胞正常的形态和功能 ________________________ 。 4. 气体环境 O2 ： 细胞代谢所必需 （ 1 ）气体组成及作用： CO2维持培养液的 ： pH （ 2 ）具体操作： 通常采用培养皿或松盖培养瓶。 置于含有 95% 空气和 5%CO2 的混合气体的 CO2 培养箱 中进行培养。 三、动物细胞培养的过程 取动物组织 取动物组织 制成细 转入培养液进 胞悬液 行原代培养 传代培养 放入 CO2 培养 箱中培养 制成细胞悬 液 转入培养液进行原代培 养 细胞贴壁 放入 CO2 培养 箱中培养 接触抑制 分瓶 进行传代培 养 12/22/22 1. 取动物组织 （ 1 ）取材一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。 : （ 2 ）取材原因 细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养 : 2. 制成细胞悬液 （ 1 ）将组织分散成单个细胞 ① 方法 :机械法 用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间 ② 原因 : Ⅰ. 从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼 此限制了生长和增殖； Ⅱ. 能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。 （ 2 ）用培养液将细胞制成细胞悬液。 进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞 ，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用 胃蛋白酶行吗？ 用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物 质主要是蛋白质。 胃蛋白酶作用的适宜 pH 约为 2, 当 pH 大 于 6 时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物 细胞培养的适宜 pH 为 7.2 ～ 7.4 ，胃蛋白 酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不 行。 3. 原代培养 （ 1 ）操作方法： 将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环 境中培养。 （ 2 ）体外培养的动物细胞类型 ① 悬浮生长类： 能够悬浮在培养液中生长增殖。 会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物 质缺乏等因素而分裂受阻。 需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁） ② 贴壁生长类： ，大多数细胞属于此类。 除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触 抑制现象。 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止 接触抑制： 分裂增殖。 4. 分瓶、进行传代培养 （ 1 ）需分瓶进行传代培养的原因： 悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和 培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增 殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象 （ 2 ）方法： ① 收集细胞 a. 悬浮生长类： 直接用离心法收集 重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞 b. 贴壁生长类： ，然后再用离心法收集 ② 将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养 重要名词解释 ① 原代培养： 处理 通常将 ________ 分瓶之前 的细胞培养，即动物组织经 _____ 后的初次培养 ________ 称为原代培养； ② 传代培养： 将 ______ 分瓶后 的细胞培养称为传代培养； 大多数 贴附于某些基质表面才 ③ 细胞贴壁： ______ 体外培养的细胞需要 ___________________ 能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的 ____ 瓶壁 上，这种现 象称为细胞贴壁； ④ 接触抑制： 当 _____ 贴壁细胞生长到 _____________ 表面相互接触 时，细胞通常 会 _____________ ； 停止分裂增殖 动物细胞培养的过程归纳： 动物胚胎、幼龄动 取动物组织 物 机械法或胰蛋白酶、 用培养液将细胞制成细胞悬 胶原蛋白酶处理将组 液 织分散成单个细胞 制成细胞悬液 大多数需要贴附于某些 基质表面才能生长增殖 一类细胞能够悬浮在 转入培养液进 培养液中生长增殖 行原代培养 直接用离 心法收集 分瓶 重新用胰蛋白酶等处 理，使之分散成单个 细胞，然后再用离心 法收集 进行传代培养 有关动物细胞培养的问题 1. 幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞 与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？ 细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖 能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一 般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样 ，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。 2. 动物细胞培养和植物组织培养有什么相同和不同之处？ 动物细胞培养和植物组织培养的比较 原理 培养前处理 取材 培养基的物理性 质 植物组织培养 植物细胞的全能性 离体 离体植物器官、组织、细胞 固体 培养基的成分 有机营养成分 无机营养成分 植物激素 特有成分 植物激素 动物细胞培养 细胞增殖 用机械法或胰蛋白酶、胶原 蛋白酶将组织细胞分散开 动物胚胎或幼龄动物的组织 、器官 液体 ( 又称培养液 ) 糖类、氨基酸、无机 盐、维生素等营养物 质及一些天然成分如 血清 血清 动物细胞培养和植物组织培养的比较 特殊环境条件 结果 是否体现细胞的 植物组织培养 动物细胞培养 再分化需光 气体环境 一般获得新的植株 获得大量细胞 是 否 全能性 外植体 脱分化 过程 相同点 12/22/22 愈伤组织 再分化 根、芽 取动物组织 制成细胞悬液 转入培养液进行原代培养 分瓶 移栽成活 幼苗 完整植株 进行传代培养 ① 培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分 裂； ② 均需无菌操作，需要适宜的温度、 pH 等条件。 四、干细胞培养及其应用 1. 干细胞的概念： 动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力 的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞 。 2. 干细胞的分布： 干细胞存在于 _________ 早期胚胎 、 _____ 骨髓和 _______ 脐带血等多 种组织和器官中； 3. 干细胞的分类： 包 括胚胎干细胞和成体干细胞等。 （ 1 ）胚胎干细胞（简称 ES 细胞） ① 分布： 存在于 早期胚胎 ________ 中 ② 特点： 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并 进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 ③ 应用实例： ES 细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和 造血干细胞等 （ 2 ）成体干细胞 ① 分布：存在于 成体组织或器官内 ________________ 中 骨髓中的 ___________ __________ 、 ② 举例： 造血干细胞 、神经系统中的神经干细胞 睾丸中的 ___________ 等； 精原干细胞 ③ 特点： 一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特 定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 ④ 发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例：造血干细胞 _____________ 主要存在于成体的骨髓 _____ 、 _______脐带血 和 ______ 外周血 中 4. 干细胞的应用 （ 1 ）应用原理： 有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、 器官的发育、再生和修复等密切相关。 （ 2 ）应用实例： 造血干细胞： 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造 血系统、免疫系统功能障碍等疾病 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕 神经干细胞： 金森病、阿尔茨海默病等） （ 3 ）面临的问题： 存在导致肿瘤发生的风险 （ 4 ）应用展望： 干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领 域发挥大作用。 5. 诱导多能干细胞（ iPS 细胞） （ 1 ）胚胎干细胞的局限性： 胚胎干细胞必须从 胚胎 _____ 中获取 ，涉及 伦理问题 ________ ； 因而限制了在医学上的应用。 （ 2 ）诱导多能干细胞概念： 通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细 胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称 iPS 细胞。 诱导方法：① 将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以 及已分化的 T 细胞、 B 细胞均可）； ② 用小分子化合物诱导形成。 （ 3 ）诱导多能干细胞优点： ① 诱导过程无须破坏胚胎； ②iPS 细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病 人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。